24.11.2022, 11:00 Uhr
Biologiezentrum Universität Wien
Djerassiplatz 1
1030 Wien
Titel: „Genotyping the Rh Blood Group System through Next
Generation Sequencing“
Kurzfassung:
Blutgruppenbestimmung ist ein wesentlicher Bestandteil der klinischen Medizin und die
Grundlage fur sichere Bluttransfusionen. Keine oder fehlerhafte Blutgruppenbestimmung
kann zu schweren Schaden und zum Tod fuhren (Mitra et al., 2014). Aktuell sind 343
Blutgruppenantigene innerhalb von 43 Blutgruppensystemen bekannt (International Society
of Blood Transfusion, 2021). Die Blutgruppensysteme ABO, gefolgt von Rh, sind von
höchster klinischer Relevanz (Westho , 2004). Das Rh-Blutgruppensystem umfasst die
beiden eng miteinander verbundenen Gene RHD und RHCE, die 97% Sequenzidentitat
teilen und in der genomischen Organisation verwandt sind. Das Rh-Blutgruppensystem
ist aufgrund der 55 bekannten Antigene und der strukturellen Varianten, wie RHD/RHCEHybriden
und Gendeletionen, das polymorphste Blutgruppensystem (Daniels, 2013; International
Society of Blood Transfusion, 2021).
Diese Masterarbeit stellt das Softwaretool rh genotyping vor. Dieses Tool ermöglicht
es dem Benutzer mit nur wenigen Befehlen gezielte Next Generation Sequencing (NGS)
Daten zu analysieren. Einerseits wendet es aktuelle Software an, um Standardaufgaben
der Sequenzanalyse zu lösen, wie zum Beispiel Read-Trimming, Short-Read-Mapping,
Alignment-Processing und Variant-Calling. Andererseits ergänzt es neue algorithmische
Ansätze zur Erstellung von Coverage-Plots, zur Bestimmung des am besten passenden
Genotyps und zur Berechnung der Copy Number Variations (CNV). Coverage-Plots dienen
als grobe Qualitatskontrolle der Sequenzierungsreaktion und erlauben vorlau ge Ruckschlusse
auf das Vorhandensein oder Fehlen von Genen und Exons zu ziehen. Die Bestimmung des
am besten passenden Genotyps erfolgt durch die Zuordnung einer Menge von Single Nucleotide
Polymorphisms (SNPs) und Insertions and Deletions (INDELs) zu bereits bekannten
Genotypen. Dabei muss sowohl die Zygositat von Mutationen, als auch die Tatsache,
dass einige Allele Subtypen voneinander sind, berucksichtigt werden. Die CNV-Analyse
bestimmt und visualisiert numerische Verhältnisse von Sequenzierungs-Reads, die entweder
RHD oder RHCE zuzuordnen sind. Es wird angenommen, dass das Verhaltnis der Reads
über alle Sequenzierungszyklen konstant ist.
15 der 24 analysierten Proben enthalten RHD-Allele, die sich vom Referenzgen ausschließ
lich durch SNPs und INDELs unterscheiden. Für diese Proben bestätigt oder verfeinert
(4 Fälle) der implementierte Ansatz die vorherige laboratorische Bestimmung. Für
die verbleibenden 9 Proben ist der auf Variant Calling basierte Ansatz nicht geeignet. Die
CNV-Analyse klassifizierte hierbei 3 Proben als RHD+-, 2 Proben als RHD????-Typen und 3
weitere als RHD/RHCE Hybriden. Die RHD Exon 8 Deletion einer weiteren Probe konnte
weder durch das Variant Calling noch duch die CNV Analyse nachgewiesen werden. Bei
RHCE konnte in 13 von 24 Fallen der Genotyp genau zugeordnet werden. 8 Proben, die
ein C-Allel tragen konnten nicht korrekt zugeordnet werden, da die verwendeten Sequenzierungsprimer
das Exon 2 des C-Allels nicht amplifizierten.
Es hat sich gezeigt, dass eine Genotypisierung des Rh-Blutgruppensystems durch Next-
Generation-Sequencing machbar ist, jedoch eine aufwändige bioinformatische Analyse erforderlich
ist (Wu et al., 2018; Furst et al., 2020). Das Tool rh genotyping steuert eine
einfach anzuwendende und bioinformatisch fundierte Methode zur Analyse von Rh-Sequenzierungsdaten
bei.